目标：表达结核分枝杆菌膜卵白MmpL5及MmpS5-MmpL5外排泵系统，切磋其正在贝达喹啉耐药中的感化。方式：建立结核分枝杆菌外排泵卵白MmpL5及MmpS5-MmpL5的乙酰胺型表达载体，正在耻垢分枝杆菌中表达MmpL5卵白及MmpS5-MmpL5卵白，测定表达菌株的发展特征及其外排能力，同时切磋贝达喹啉对表达菌株最小抑菌浓度的变化取对菌体三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量的影响。成果：成功正在耻垢分枝杆菌中表达结核分枝杆菌膜卵白MmpL5及MmpS5-MmpL5，表达菌株的发展不受影响，共表达MmpS5-MmpL5卵白的菌株外排能力添加，导致其对溴化乙锭的堆集量（△荧光强度为395）较表达MmpL5卵白组（△荧光强度为655）和照顾pMV261s空质粒组（△荧光强度为642）削减约40%。贝达喹啉对MmpS5-MmpL5沉组耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度由0.25 μg/ml提高到2 μg/ml，添加了8倍。贝达喹啉将MmpS5-MmpL5沉组耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量[（0.197±0.018）μmol/L]降低36.49%[（0.125±0.010）μmol/L]。MmpL5单表达不克不及构成外排泵，也对贝达喹啉无影响。结论：结核分枝杆菌的膜卵白MmpL5和MmpS5需要共表达才能正在耻垢分枝杆菌中阐扬感化，降低贝达喹啉的药物性。MmpS5-MmpL5卵白表达系统的成立为进行贝达喹啉的具体转运机制研究奠基了根本。
利用SPSS 26.0软件进行数据处置及阐发，计量材料合适正态分布，采用“x¯±s”描述，多组间差别的比力采用单要素方差阐发，进一步的组内两两比力采用student t查验，以P＜0.05为差别有统计学意义。
将测序验证准确的含mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的质粒及空质粒电转入耻垢分枝杆菌感触感染态细胞，电转前提为电压2500 V、电容25 μF，电阻1000 Ω，电杯厚度2 mm。后于含10% OADC添加剂的7H9培育基中37 ℃恒温摇床继续培育4 h，吸收必然体积涂布正在含终浓度为50 μg/ml的卡那霉素的LB平板上，挑取单克隆于7H9＋10% OADC＋50 μg/ml卡那霉素培育基培育。
虽然编码ATP合成酶的atpE基因突变取Bdq耐药相关，但正在Bdq医治的临床患者平分离的很少。临床上起首发觉且报道最多的是Rv0678基因突变。笔者前期研究也正在中国MDR-TB患者平分离到了Bdq和氯法齐明的原发耐药株，发觉MTB的Rv0678突变会导致其对Bdq取氯法齐明的交叉耐药。Rv0678基因是MmpS5-MmpL5系统的因子，Rv0678基因突变会惹起外排泵基因mmpS5及mmpL5的过表达。
本研究通过Bdq对3种沉组菌株的药物性试验发觉，共表达MmpS5-MmpL5卵白的耻垢分枝杆菌会降低Bdq对其的活性，而仅表达MmpL5卵白的沉组耻垢分枝杆菌对Bdq的药物性无影响。这取Yamamoto等发觉MmpS5促使MmpL5卵白单聚体拆卸成三聚体阐扬功能的成果分歧。EtBr是一种荧光染料，是大都外排泵的转运底物，凡是被用做测试药物外排泵活性的通用型底物。沉组耻垢分枝杆菌对EtBr的堆集尝试表白，MmpS5-MmpL5卵白表达比MmpL5卵白零丁表达和空质粒组对EtBr的堆集量较少，其外排能力添加。零丁MmpL5卵白表达取空质粒比拟没有差别，进一步申明MmpS5和MmpL5卵白共表达构成外排泵，阐扬生物学功能。贝达喹啉的感化靶点是ATP合成酶，进而导致菌体内的ATP合成削减而阐扬抗菌感化。为了调查Bdq通过MmpS5-MmpL5卵白外排影响菌体内ATP程度，笔者正在1/2 MIC浓度的Bdq感化下，发觉共表达MmpS5-MmpL5卵白的耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量较表达MmpL5卵白和照顾空质粒组变化小。连系MmpS5-MmpL5卵白共表达导致的外排能力加强，表白MmpS5-MmpL5卵白外排系统以Bdq为底物，通过添加Bdq的外排量使菌体内Bdq的含量降低，进而使Bdq靶点ATP合成酶的量削减，导致菌体内ATP程度的变化较少。
将3种细菌培育至对数发展期，用7H9＋10%OADC培育基将菌液稀释至终浓度为1×105 CFU/ml。取96孔黑色培育板，顺次将异烟肼及Bdq倍比稀释。37 ℃培育3 d后，各孔插手20 μl的阿尔玛蓝和12.5 μl的20%吐温-80，37 ℃继续培育24 h，记实各孔颜色，蓝色暗示菌株无发展，红色暗示有菌发展，MIC暗示由蓝色变为红色的的最低药物浓度。
考虑到耻垢分枝杆菌基因组取MTB高度同源，笔者前期正在大肠杆菌中多次测验考试表达但成果仍不抱负。MmpS5-MmpL5的功能尚不清晰。笔者采用耻垢分枝杆菌做为模式菌研究，Bdq（上海瀚喷鼻生物科技公司。
1.仪器：Nuaire701二氧化碳恒温培育箱（美国Nuaire公司）、Infinite 200多功能酶标仪（Tecan公司）、GENEPRO多功能基因扩增仪（杭州博日科技股份无限公司）、Amersham Imager 600卵白成像仪（美国GE公司）、Max-Q8000低温摇床（美国赛默飞世尔科技公司）、DS-11FX超微量分光光度计（美国DeNovix公司）、Tanon-4200全从动数码凝胶成像系统（上海天能科技无限公司）。
膜卵白的表达取纯化一曲是卵白研究的手艺难题，笔者课题组前期正在BL21plys大肠杆菌及C43大肠杆菌中多次测验考试表达膜卵白MmpL5卵白都未能获得抱负成果，可能是外源膜卵白正在大肠杆菌中的毒性、错误折叠、堆积等导致表达量低。MTB的MmpL5取耻垢分枝杆菌同源MSMEG_1382的序列类似性为62.96%，表白MmpL5卵白表达响应的前提正在耻垢分枝杆菌可能具备。耻垢分枝杆菌无传染性和致病性，发展较快、操做较为容易。这些特点都是耻垢分枝杆菌做为表达宿从菌的劣势。乙酰胺酶启动子是一种强启动子，正在耻垢分枝杆菌中遭到严谨调控，后高程度表达。Zhang等操纵乙酰胺酶启动子建立了MmpL3表达载体，成功实现了正在耻垢分枝杆菌中表达和纯化。本研究通过pMV261穿越载体，成立了带有组氨酸标签的乙酰胺型表达载体pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5，卵白免疫印迹验证了卵白正在耻垢分枝杆菌的成功表达。
MmpS5-MmpL5卵白属于RND超家族外排泵，EtBr常被用做测试药物外排泵活性的通用型底物。离心收集培育至对数发展期的3种细菌，并用PBS沉悬洗涤菌体2次，调理各菌A600值为0.4，吸收198 μl沉悬菌液，插手2 μl浓度为100 μg/ml的EtBr至终浓度为1 μg/ml，混匀，当即用Infinite M200多功能酶标仪检测荧光值，设置激发波长为545 nm，发射波长为590 nm，每隔5 min检测1次，共检测60 min，设置3个生物学反复。
贝达喹啉（bedaquiline，Bdq）可以或许结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成酶,有着主要的灭菌活性，是缩短结核病疗程和医治耐药结核病的环节新药。2018年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将Bdq列为医治耐多药结核病（MDR-TB）或利福平耐药结核病（RR-TB）的A组药物。Bdq的临床耐药株很快呈现，火急需要对其耐药机制进行深切研究，以便正在临床大规模利用该药品时，可以或许合理用药，降低耐药率的发生。
为调查MmpL5和MmpS5-MmpL5卵白的表达能否影响耻垢分枝杆菌的发展特征，比力3种细菌的发展曲线基因的耻垢分枝杆菌取照顾pMV261s空质粒的耻垢分枝杆菌，均正在15 h之后进入对数发展期，25 h达到平台期，三者发展特征没有较着差别（图8）。
为了验证外源基因表达对耻垢分枝杆菌发展的影响，测定了空质粒、表达MmpL5及MmpS5-MmpL5的菌株的发展曲线种细菌培育至对数发展期后，调整A600值分歧，之后按1%接种正在含0.05%吐温-80的7H9+10%OADC培育基中，37 ℃恒温摇床继续培育，每隔5 h测定1次A600值，每个样品设置2个生物学反复，绘制发展曲线。
提取的卵白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封锁2 h，插手1∶2000的抗组氨酸鼠源IgG单克隆抗体一抗，TBST缓冲液洗去一抗，插手1∶5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST缓冲液洗去二抗，插手辣根过氧化物酶显色剂孵育后，进行化学显色检测。
通过pMV261穿越载体，添加乙酰胺酶启动子基因（pACE），并添加组氨酸标签便于沉组卵白的验证及纯化，成立带有组氨酸标签的乙酰胺可型表达载体pMV261s。对耻垢分枝杆菌乙酰胺酶启动子基因进行PCR扩增，片段长度为2618 bp（图1），毗连pLB克隆载体成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ双酶切后目标条带大小准确（图2），正在乙酰胺酶启动子基因上有HindⅢ酶切位点，正在含组氨酸标签的序列上有EcoRⅠ酶切位点，双酶切后片段长度为1584 bp（图3）。由此证明组氨酸标签毗连成功，同时测序验证准确，pMV261s载体建立成功。
对经乙酰胺的pMV261s-mmpL5、pMV261s-mmpS5-mmpL5沉组菌株及pMV261s空质粒菌株进行卵白免疫印迹阐发，MmpL5卵白相对证量为104 800，MmpS5-MmpL5卵白相对证量为120 100，加上6×His组氨酸标签构成的沉组卵白，正在相对证量为110 000～130 000处呈现目标条带，而空质粒菌株没有条带（图7），表白MmpL5及MmpS5-MmpL5卵白正在耻垢分枝杆菌中成功表达。
以期为后续卵白纯化并研究Bdq的转运机制奠基根本。批号：20200518；纯度≥99%）。膜卵白的表达取纯化一曲是研究膜卵白功能的手艺难题。正在载体上插入用于调控乙酰胺酶表达的可型启动子，并对其功能进行了研究，批号：MKBV9475V；耻垢分枝杆菌属快发展分枝杆菌且具有无致病性及传染性等长处，建立了MmpL5和MmpS5-MmpL5卵白正在耻垢分枝杆菌中的表达系统，其卵白布局尚无解析，MmpL5是多沉跨膜的膜卵白，纯度≥98%）、异烟肼（美国Sigma公司；对pMV261载体进行，
异烟肼对表达MmpL5及MmpS5-MmpL5卵白的沉组耻垢分枝杆菌及照顾空质粒的耻垢分枝杆菌的MIC均为1 μg/ml，表白异烟肼不是MmpS5-MmpL5卵白外排系统的底物。Bdq对表达MmpL5卵白及带有空质粒的耻垢分枝杆菌的MIC值为0.25 μg/ml，而对表达MmpS5-MmpL5卵白的耻垢分枝杆菌的MIC为2 μg/ml，MIC值提高了8倍。由此证明，MmpL5取MmpS5卵白共表达才能阐扬感化，且MmpS5-MmpL5卵白的表达导致Bdq的耐药。
外排泵可以或许将菌体内药物泵出，外排泵过表达使得菌体内药物浓度不克不及无效分枝杆菌发展，是MTB耐药的主要缘由之一。MmpL是分枝杆菌基因组编码的一组膜卵白，属于外排泵RND卵白超家族，正在脂质、聚合物和免疫调理剂的运输过程中阐扬主要感化。笔者团队前期研究发觉，Bdq和氯法齐明对Rv0678突变的MTB交叉耐药，Rv0678突变导致mmpL5和mmpS5表达的上调。近年研究表白，MmpS5-MmpL5系统也能够转运分枝菌素。MTB编码13种MmpL卵白，此中，MmpL5卵白（Rv0676c基因编码）由964个氨基酸构成，理论相对证量为104 800，由12个跨膜布局域及2个周质布局域构成。从属卵白MmpS5（Rv0677c基因编码）由142个氨基酸构成，理论相对证量为15 200。mmpL5正在上取mmpS5基因相偶联，二者位于统一子内，受下逛的因子Rv0678的调控。Andries等正在MTB中零丁过表达MmpS5卵白没有改变Bdq对其的MIC值，提醒单一的MmpS5卵白对药物外排无影响，因而，本研究中没有零丁建立MmpS5卵白。
综上所述，笔者建立了MTB的膜卵白MmpL5及外排泵MmpS5-MmpL5正在耻垢分枝杆菌中的表达系统。功能尝试也表了然MmpS5-MmpL5卵白共表达构成外排泵阐扬感化，降低Bdq的药物性。本研究深化了对Bdq耐药机制的理解，而膜卵白表达系统的成立为卵白的纯化和进一步研究Bdq的转运机制奠基了根本。
2.试剂：pMV261质粒为本尝试室保留；KpnⅠ（R0142V）、BamHⅠ（R0136V）、EcoRⅠ（R0101V）、HpaⅠ（R0105V）、HindⅢ（R0104V）均购自美国纽英伦生物手艺公司；i DH5α购自宝生物工程（大连）无限公司（批号：R2015V）；pLB零布景快速毗连试剂盒购自天根生化科技（）无限公司（批号：VT205）；ATP检测试剂盒（S0026）、特超敏ECL化学发光试剂盒（P0018AS）、苯甲基磺酰氟（PMSF；ST506）、细胞膜卵白取细胞浆卵白提取试剂盒（P0033）均购自上海碧云生成物手艺无限公司。
待菌液培育至波长600 nm处吸光度值（A600值）等于0.8，插手终浓度为0.2%的乙酰胺溶液卵白表达，37 ℃前提下继续培育20 h，收集表达后的菌液，离心后弃上清，菌沉淀用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）沉悬，离心弃上清，菌沉淀插手细胞膜卵白取细胞浆卵白抽提试剂A和PMSF，悬浮后冰浴10～15 min，高压破裂仪破裂菌体，4 ℃ 1200×g离心10 min，收集上清液，继续14 000×g离心30 min，吸除上清，沉淀插手膜卵白抽提试剂B，振荡后冰浴14 000×g离心 5 min，抽提膜卵白。
取培育至对数发展期的3种细菌，用7H9培育基调理A600值为0.4，向菌液中插手终浓度为1/2 MIC（0.125 μg/ml）的Bdq，孵育24 h，离心收集等体积的3种细菌，离心后弃上清，菌沉淀插手裂解液，振荡混匀。96孔黑色培育板中插手100 μl裂解菌液和100 μl稀释后的ATP检测液，酶标仪测定相对光单元（relative light unit，RLU）值，按照尺度曲线及测定的RLU值计较出各菌液中的ATP含量。
首都医科大学从属胸科病院耐药结核病研究市沉点尝试室/市结核病肿瘤研究所药物研究室， 101149
PCR方式扩增MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5基因，mmpL5片段长度为2895 bp，mmpS5-mmpL5片段长度为3320 bp，目标基因条带大小准确（图4），EcoRⅠ和HpaⅠ双酶切目标基因及pMV261s表达载体，双酶切条带大小准确（图5，6），测序成果无突变。
检测沉组耻垢分枝杆菌对EtBr的堆集，发觉表达MmpL5卵白取照顾有pMV261s空质粒的耻垢分枝杆菌对EtBr的堆集大致不异（△荧光强度值别离为655和642），而表达MmpS5-MmpL5卵白的耻垢分枝杆菌对EtBr的堆集）（△荧光强度值为395）较MmpL5组和pMV261s空质粒组削减约40%（表1），申明MmpS5-MmpL5卵白具有外排能力，而没有MmpS5的MmpL5卵白不克不及构成外排泵。